P16-D淀粉样多肽促进逆转录病毒感染以及在流感免疫中的应用

【摘要】提高基因治疗的效率需要合适的基因载体系统和逐渐发展的用于增强基因转导化合物的使用。逆转录病毒载体使外源基因在宿主细胞内实现稳定、长期的表达而占有很大的优势。病毒与靶细胞表面的负电荷产生的静电斥力大大限制了基因转导的效率。用于增强基因转导的化合物从最初的阳离子化合物Poly-L-lysine等发展至今，商品化的DEAEdextran和polybrene仍被人们广泛应用于基因转导的实验中。最近的研究表明，淀粉样纤维多肽在促进基因转导过程中具有突出的优势，如SEVI和EF-C，已经被人们证实可以提高逆转录病毒基因转导的效率，而且显著强于DEAE和polybrene。最近我们发现合成的HIV-14E10表位多肽P13（Ac-671NWFDITNWLWY-IK683-NH2）及其衍生肽P16（Ac-671NWFDITNWLWYIK683KKK-NH2），P16在P13序列C末端增加三个赖氨酸，也能够形成淀粉样纤维结构促进HIV-1感染，并且效率强于SEVI。对P13和P16促感染机理的研究表明，芳香族氨基酸色氨酸和碱性氨基酸赖氨酸对P16的促感染活性很重要。由它们的作用方式来看，淀粉样纤维和正电性是多肽多聚物行使功能的必要条件。本文的研究主要是在有利于淀粉样纤维结构形成的前提下，对P16序列中的酸性氨基酸–天冬氨酸进行突变或增加序列中碱性氨基酸的数目，以期获得促感染活性更好的多肽。实验中合成的多肽有P16-D、P16-K、P16-N、P16-2W和P16-W3K。对合成的多肽进行MS和HPLC的质量检测无误后，按照P16发挥最佳感染增强效果的条件，即在无血清条件下感染4h后再补加血清或更换为完全培养基，我们对合成的P16衍生肽的促感染活性进行了研究。综合考虑促进病毒感染的效率和细胞毒性两个因素，选用P16-D（Ac-671NWFAITNWLWYIK683K-KK-NH2）为研究对象。病毒感染实验结果表明P16-D与P16增强病毒感染的倍数分别是13.9和7.5，充分说明改造后的P16-D的促感染活性在P16基础上提高将近100%，同时与最适作用浓度DEAE和polybrene相比，促感染过程中细胞存活率分别是90%与80%左右，P16-D对靶细胞的毒性更低。TEM、Tht特异性结合实验及EGCG实验表明P16-D经过低速搅拌形成典型的淀粉样纤维结构，能够有效地捕获靶细胞和病毒颗粒，同时也使病毒颗粒通过简单地低速离心就可以达到浓缩的目的。P16-D淀粉样纤维的促感染活性对HIV-1以外的包膜病毒—流感病毒及FIV载体系统也适用。鉴于P16-D淀粉样多肽也能有效地捕获流感病毒颗粒；在P16-D存在时，流感病毒的血凝效价比不加多肽组提高4倍；流感病毒感染MDCK细胞后，检测上清里的病毒量，加肽组明显高于不加肽组，预示着P16-D淀粉样多肽将在流感病毒免疫中发挥特殊的作用。理想的病毒抗原经免疫后应该既能引起体液免疫，又能引起细胞免疫。考虑到P16-D纤维能够有效地结合流感病毒颗粒，在细胞水平上促进流感病毒的感染，我们选择降低剂量的流感病毒配合P16-D淀粉样纤维一起使用后，经鼻腔接种小鼠后，特异性IgG抗体水平低于正常剂量病毒组，但是分型抗体IgG1的水平比后者要高，IgG2a的水平则与之相当，表明降低剂量的减毒流感病毒配合P16-D淀粉样多肽使用，也能够刺激机体产生有效的免疫应答。综上，P16-D优越的促感染活性预示着它将在逆转录病毒感染和基因治疗中具有广阔的应用前景，同时，它在减毒的流感免疫中的应用不仅帮助人们优化免疫方案，降低生产成本，而且推动了对淀粉样纤维多聚物的深入认识。
【作者】张华艳；
【导师】单亚明；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】基因转导；P16衍生肽；淀粉样纤维；正电性；减毒流感；降低剂量的；免疫应答；

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